Nació en Villadiego (Burgos) el 21 de julio de 1702. Fue hijo de don Pedro José Flórez de Setién Calderón de la Barca y de doña Josefa de Huidobro y Velasco Puelles.
Tomó el hábito en el convento de San Agustín de Salamanca en 1718, profesando al año siguiente, y trasladándose al colegio agustiniano de Valladolid donde realizaría los estudios de filosofía. Posteriormente regresa a Salamanca para cursar la teología. Terminó la carrera eclesiástica en 1725 presentándose ese mismo año en el colegio madrileño de Doña María de Aragón (hoy, sede del Senado), a las oposiciones a Lector en Artes y obteniendo el primer puesto que debería desarrollar en el colegio de Madrigal de las Altas Torres (Ávila). Se ordenó sacerdote el 25 de julio de 1725.
En otoño fue trasladado a la ciudad de Ávila, en cuya Universidad superó las pruebas y se graduó de Bachiller, Licenciado y Doctor; pocos días después el superior Provincial, P. Francisco Avilés, le ordenó que se trasladase al colegio agustiniano de Alcalá para graduarse de Doctor en aquella Universidad.
Su presencia en Alcalá, y los grados académicos obtenidos en su Universidad estaban orientados al acceso a una cátedra; se presentó todas las veces que vacaron las de teología, mientras residió en la ciudad, siete en total, sin lograrla en ninguna ocasión.
A los cuarenta años toma la decisión de dedicarse al estudio sistemático y profundo de la Historia antigua de la Iglesia de España, y da los pasos para demostrar la firmeza de su resolución. En 1743 renuncia a su cargo de Rector del Colegio de Alcalá y comienza su formación. Consultó el proyecto con su buen amigo don Juan de Iriarte, bibliotecario de Palacio, quien no solamente lo animó, sino que le sugirió ampliar la idea hasta hacer una Historia General de la Iglesia de España, que podía llamarse España Sagrada, comprendiendo el servicio que, desde el estudio y la investigación, se podía hacer a la Iglesia de España.
Conocedor de los méritos, Fernando VI tomó bajo su real protección la magna obra de la España Sagrada –ya se habían publicado 5 tomos– concediendo al P. Flórez al año siguiente una pensión anual de 600 ducados. Estimulada por el reconocimiento que estaba tomando Flórez y su obra, la Orden agustiniana designó al P. Francisco Méndez como su ayudante y amanuense; a partir de 1749 este religioso le acompañará siempre hasta su muerte.
En Marzo de 1751 se le concedió la cátedra segunda de Santo Tomás, cuando ya no residía en Alcalá por estar ocupado en el proyecto de la España Sagrada. En abril de 1758, consciente de esa limitación y dando ejemplo de ética profesional, renunció a la cátedra.
Otro aspecto fundamental en la vida de Flórez es su condición de religioso; supo compaginar el horario conventual y las actividades comunitarias con su tarea investigadora. Fue de ánimo desprendido y espíritu generoso, salvo para los libros y las piezas de las colecciones que tanto esfuerzo le costaron reunir.